Sådan gør du spektrofotometrisk analyse: 13 trin (med billeder)

Spektrofotometri er en eksperimentel teknik, der bruges til at måle koncentrationen af opløste stoffer i en specifik løsning ved at beregne mængden af lys, der absorberes af disse opløste stoffer. Denne teknik er stærk, fordi visse forbindelser vil absorbere forskellige bølgelængder af lys ved forskellige intensiteter. Ved at analysere det lys, der passerer gennem opløsningen, kan du identificere særlige opløste stoffer i opløsning, og hvordan koncentreret disse stoffer er. Et spektrofotometer er enheden, der bruges til at analysere løsninger i en laboratorieforskningsindstilling.

Trin

Del 1 af 3:

Forberedelse af prøverne

1. Tænd for spektrofotometeret. De fleste spektrofotometre skal varme op, før de kan give en præcis læsning. Tænd for maskinen og lad den sidde i mindst 15 minutter før du kører eventuelle prøver.

Brug opvarmningstiden til at forberede dine prøver.

BILLEDE Titled DO spektrofotometrisk analyse Trin 2

2. Rengør kuvetter eller testrør. Hvis du laver et laboratorium til skole, kan du bruge engangstestrør, der ikke behøver at blive rengjort. Hvis du bruger kuvetter eller genanvendelige testrør, skal du sørge for, at de er ordentligt rengjort før brug. Skyl hver kuvette grundigt med deioniseret vand.

Pas på kuvetter, da de kan være ret dyre, især hvis de er lavet af glas eller kvarts. Quartz Cuvettes er designet til brug i UV-synligt spektrofotometri.

Når du håndterer kuvetten, skal du undgå at røre siderne, hvor lyset passerer igennem (generelt de klare sider af beholderen). Hvis du ved et uheld rører på disse sider, skal du tørre kuvetten ned med en kimwipe (som formuleres for at forhindre ridser af glasset).

Billedbetegnelse Do spektrofotometrisk analyse Trin 3

3. Indlæs det korrekte volumen af prøven i kuvetten. Nogle kuvetter har et maksimalt volumen på 1 milliliter (ml), mens testrørene kan have et maksimalt volumen på 5 ml. Så længe laseren, der producerer lyset, passerer gennem væsken og ikke en tom del af beholderen, får du en præcis læsning.

Hvis du bruger en pipette til at indlæse dine prøver, skal du bruge et nyt tip til hver prøve for at forhindre krydskontaminering.

BILLEDE TITLET DO SPECTROPHOTOMETRISK ANALYSE Trin 4

4. Forbered en kontrolopløsning. Kendt som et emne har kontrolopløsningen kun det kemiske opløsningsmiddel, hvori det opløses, der skal analyseres, opløses i. For eksempel, hvis du havde salt opløst i vand, ville dit blankt være bare vand. Hvis du farve vandet rødt, skal emnet også indeholde rødt vand. Blanket er det samme volumen, da opløsningen analyseres og holdes i samme type beholder.

BILLEDE TITLET DO SPECTROPHOTOMETRISK ANALYSE Trin 5

5. Tør ydersiden af kuvetten. Før du placerer kuvetten i spektrofotometeret, vil du sørge for, at det er så rent som muligt for at undgå interferens fra snavs eller støvpartikler. Brug en lintfri klud, fjern eventuelle vanddråber eller støv, der kan være på ydersiden af kuvetten.

Del 2 af 3:

Kører eksperimentet

1. Vælg og sæt lysets bølgelængde for at analysere prøven med. Brug en enkelt bølgelængde af lys (monokromatisk farve) for at gøre testen mere effektiv. Farven på det valgte lys skal være en kendt for at blive absorberet af et af kemikalierne, der menes at være i testopløsningen. Indstil den ønskede bølgelængde i henhold til specifikationerne for dit spektrofotometer.

I et klasseværelse laboratorier vil bølgelængden sandsynligvis blive givet til dig.
Fordi prøven afspejler alt lys af samme farve som det fremgår, vil den eksperimentelle bølgelængde altid være en anden farve end den for prøven.

Objekter vises som visse farver, fordi de afspejler lys af bestemte bølgelængder og absorberer alle andre farver. Græs er grønt, fordi chlorophyll i det afspejler grønt lys og absorberer alt andet.

BILLEDE Titled Do spektrofotometrisk analyse Trin 7

2. Kalibrere maskinen med blanket. Placer blanket i kuvetteholderen og luk låget. På et analog spektrofotometer vil der være en skærm med en nål, der bevæger sig ud fra intensiteten af lysdetektion. Når emnet er i, skal du se nålen Flyt til højre. Optag denne værdi, hvis du har brug for det til senere. Med emnet stadig i maskinen skal du flytte nålen til nul ved hjælp af justeringsknappen.

Digitale spektrofotometre kan kalibreres på samme måde, de vil bare have en digital aflæsning. Indstil emnet til 0 ved hjælp af justeringsknapperne.

Når du fjerner det tomme, vil kalibreringen stadig være på plads. Ved måling af resten af dine prøver bliver absorbansen fra emnet automatisk subtraheret ud.

Sørg for at bruge et enkelt emne pr. Session, så hver prøve er kalibreret til det samme emne. For eksempel, hvis du blinker spektrofotometeret, skal du kun analysere nogle af prøver og blanke det igen, de resterende prøver ville være unøjagtige. Du ville være nødt til at starte over.

Billedbet med titlen Do spektrofotometrisk analyse Trin 8

3. Fjern blanket og test kalibreringen. Med emnet fjernet skal nålen forblive ved 0 (nul) eller den digitale udlæsning skal fortsætte med at læse 0. Placer blanket tilbage i maskinen, og sørg for, at nålen eller aflæsningen ikke ændres. Hvis maskinen er korrekt kalibreret med dit blanke, skal alt være på 0.

Hvis nålen eller aflæsningen ikke er 0, skal du gentage kalibreringstrinnene med blanket.

Hvis du fortsætter med at have problemer, skal du søge hjælp eller få maskinen til at se på vedligeholdelse.

BILLEDE TITLET DO SPECTROPHOTOMETRISK ANALYSE TRIN 9

4. Måle absorbansen af din eksperimentelle prøve. Fjern emnet og læg den eksperimentelle prøve i maskinen. Skub kuvetten i den udpegede rille og sørg for, at den står oprejst. Vent ca. 10 sekunder, indtil nålen er stabil eller indtil de digitale tal stopper med at skifte. Optag værdierne for% transmittans og / eller absorbans.

Absorbansen er også kendt som den optiske densitet (OD).

Jo mere lys, der overføres, desto mindre lys absorberer prøven. Generelt vil du registrere de absorbansværdier, som normalt vil blive givet som en decimal, for eksempel 0.43.

Hvis du får et offlydende resultat (f.eks. 0.900 når resten er omkring 0.400), fortynd prøven og måle absorbansen igen.

Gentag læsningen for hver enkelt prøve mindst 3 gange og gennemsnitlige dem sammen. Dette sikrer en mere præcis aflæsning.

BILLEDE Titled Do spektrofotometrisk analyse Trin 10

5. Gentag testen med successive bølgelængder af lys. Din prøve kan have flere ukendte forbindelser, som vil variere i deres absorbans afhængig af bølgelængde. For at eliminere usikkerhed, gentag dine aflæsninger til 25 nm intervaller på tværs af spektret. Dette vil give dig mulighed for at registrere andre kemikalier, der mistænkes for at være i opløsen.

Del 3 af 3:

Analyse af absorbansdataene

1. Beregn transmitteringen og absorbansen af prøven. Overførsel er, hvor meget af det lys, der passerede gennem prøven, nåede spektrofotometeret. Absorbans er, hvor meget af lyset er blevet absorberet af et af kemikalierne i opløsen. Mange moderne spektrofotometre har en udgang fra transmittans og absorbans, men hvis du har optaget intensitet, kan du beregne disse værdier.

Transmitteringen (T) findes ved at dividere intensiteten af det lys, der passerede gennem prøveopløsningen med den mængde, der passerede gennem emnet. Det udtrykkes normalt som en decimal eller procentdel. T = i / i₀ hvor jeg er intensiteten af prøven og jeg₀ er intensiteten af det tomme.
Absorbansen (A) udtrykkes som det negative af Base-10-logaritmen (eksponent) af transmittansværdien: A = -log₁₀T. For en T-værdi på 0.1, værdien af A er 1 (0.1 er 10 til -1-effekten), hvilket betyder, at 10% af lyset transmitteres, og 90% absorberes. For en T-værdi på 0.01, værdien af A er 2 (0.01 er 10 til -2-effekten), hvilket betyder, at 1% af lyset transmitteres.

BILLEDE Titled Do spektrofotometrisk analyse Trin 12

2. Plot absorbansværdierne versus bølgelængderne på en graf. Absorbansværdien er plottet på den lodrette Y-akse mod lysets bølgelængde, der anvendes til en given test, der er tegnet på den vandrette X-akse. Plotting af de maksimale absorbansværdier for hver bølgelængde af lysprøvet, frembringer prøvens absorptionsspektrum og identificerer forbindelserne, der udgør teststoffet og deres proportioner.

Et absorbansspektrum har sædvanligvis toppe ved visse bølgelængder, der kan give dig mulighed for at identificere specifikke forbindelser.

BILLEDE Titled Do spektrofotometrisk analyse Trin 13

3. Sammenlign dit absorbansspektrumplot til kendte tomter af specifikke forbindelser. Forbindelser har unikt absorptionsspektrum og vil altid producere en top på samme bølgelængde hver gang de måles. Ved at sammenligne dine tomter af ukendte forbindelser med de af kendte forbindelser, kan du identificere de opløste stoffer, der komponerer din løsning.

Du kan også bruge denne metode til at identificere forurenende stoffer i din prøve. Hvis du forventer 1 klar top ved en bestemt bølgelængde, og du får 2 toppe ved separate bølgelængder, ved du, at noget ikke er rigtigt i din prøve.